Fibrosi cistica

Presso il laboratorio di Biologia Molecolare del C.M.O. sono eseguibili un gran numero di analisi fra cui la diagnosi molecolare di fibrosi cistica. La fibrosi cistica (FC) è una grave malattia ereditaria, cronica ed evolutiva. Nei pazienti affetti da FC le secrezioni delle ghiandole esocrine, (cioè i liquidi biologici come il muco, il sudore, la saliva, lo sperma, i succhi gastrici) sono molto più dense e viscose del normale. I problemi più gravi sono a carico dei polmoni, dove il muco estremamente denso può causare problemi respiratori e infezioni. I pazienti affetti da FC sono scarsamente fertili, a causa dell’eccessiva densità del loro liquido spermatico e delle secrezioni vaginali. La FC è una malattia che si trasmette con modalità autosomica recessiva, determinata da alterazioni del DNA, chiamate “mutazioni”, che insorgono in entrambe le copie del gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator). I geni vengono ereditati in coppie, derivando uno dal padre ed uno dalla madre. Negli individui malati entrambe le copie del gene per la FC sono alterate. Gli individui che possiedono una sola copia del gene alterato e una normale sono invece privi di ogni sintomo, ma sono portatori sani. I bambini malati di FC potranno nascere solo se entrambi i genitori sono almeno portatori sani. Due genitori portatori sani avranno una probabilità del 25 % di avere figli affetti da FC. Dalla stessa unione i figli avranno una probabilità su due (50%) di nascere portatori sani, come i genitori.

L’unico modo per identificare i portatori sani è quello di effettuare un test sul DNA alla ricerca di mutazioni nel gene della FC. L’analisi però è complicata dal fatto che esistono numerosissime mutazioni (ad oggi oltre 900) che causano la FC; molte di esse sono rare, molte altre ancora sconosciute. Generalmente, il test genetico viene eseguito tenendo conto di 31-200 mutazioni (a secondo del tipo di analisi effettuata), scelte fra le più frequenti nell’area geografica in questione e che nel complesso permette di identificare circa 90 per cento dei portatori.
L’analisi di mutazione del DNA viene condotta operando inizialmente una reazione enzimatica di amplificazione del DNA, conosciuta come Polymerase Chain Reaction (PCR), che consente di amplificare in vitro una specifica regione della molecola, copiandola fino ad ottenerne milioni di copie.

Infettivologia

Il nostro centro esegue indagini di infettivologia molecolare su siero, plasma, secreto biologico. Tale servizio comprende analisi qualitativa, quantitativa e genotipizzazione virale. Le tecniche utilizzate si basano sull’estrazione degli acidi nucleici (RNA e DNA) presenti nel campione con conseguente amplificazione e rilevazione in fluorescenza delle sequenze nucleotidiche virali. Il metodo utilizzato è la PCR (Polimerase Chain Reaction) REAL TIME (lettura contemporanea alla fase di amplificazione).   La REAL TIME PCR rappresenta il sistema più rapido, sensibile e specifico per la quantificazione degli acidi nucleici. Una delle applicazioni di questa tecnica è rappresentata dalla quantificazione della carica virale di agenti patogeni quali il virus HBV e HCV e dalla determinazione delle principali infezioni che si trasmettono sessualmente (HPV, N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium, T.vaginalis, G.vaginalis, Ureaplasma species in tamponi urogenitali, urina, liquido prostatico e altri materiali biologici).

HPV genotipi ad alto rischio

L’infezione genitale da HPV è una delle malattie di eziologia virale più comuni sessualmente trasmesse (Sexually Trasmitted Diseases; STDs) a livello mondiale (dal 20% al 46% nelle donne giovani sessualmente attive in diversi paesi). Il carcinoma alla cervice uterina è la seconda neoplasia più comune che coinvolge donne in tutto il mondo e secondo dati clinici e epidemiologici c’è una chiara correlazione tra i genotipi HPV e le neoplasie cervicali. Il metodo più avanzato per la diagnosi di HPV è una rilevazione diretta del DNA del virus del papilloma umano ad alto rischio cancerogeno mediante reazione a catena della polimerasi. L’identificazione dei genotipi HPV ad alto rischio è importante nella gestione del carcinoma della cervice uterina, sia come indicatore prognostico che come test di screening secondario in cui i risultati di un Pap test non sono conclusivi. I metodi basati sulla PCR sono utilizzati con successo per la rilevazione e tipizzazione dei genotipi HPV in campioni clinici come tamponi cervicali e lavaggi cervico-vaginali.

FISH

Su urine

Si tratta di un saggio di Ibridazione in situ con fluorescenza (FISH) che rileva le aneuploidie dei cromosomi 3,7,17 e la perdita del locus 9p21.

E’ l’unico test diagnostico molecolare riconosciuto come valido ausilio ed approfondimento dell’esame citologico urinario dall’ Ente americano Food and Drug Administration (F.D.A.).
trova applicazione :

• Nei pazienti con Mirco/Macroematuria Asintomatica;
• Follow-Up di pazienti con precedenti diagnosi di carcinoma uroteliale: infatti i carcinomi uroteliali presentano un elevato tasso di recidiva (50-80%) e circa il 15-25% dei casi può progredire verso un tumore invasivo.

Il risultato positivo, in ampi studi clinici, è indicativo o predittivo dell’insorgenza di patologie tumorali dell’urotelio di basso ed alto grado (pelvi renale, ureteri, vescica ed uretra) e della prostata. Tale risultato può precedere di molti mesi una cistoscopia positiva .
Il risultato negativo, nella letteratura, esclude nell’85% dei casi una patologia neoplastica uroteliale di alto grado e, solo nel restante 15% si accompagna ad una ripresa di malattia o ad una insorgenza di tumori uroteliali superficiali papillari di basso grado, facilmente rilevabili e trattabili durante l’esame cistoscopico.

Amplificazione del gene HER-2/neu

Si tratta di un saggio di Ibridazione in situ con fluorescenza (FISH) che rileva l’amplificazione del gene HER-2/neu sul cromosoma 17.
I risultati di questo test sono fondamentali per la scelta terapeutica e per l’utilizzo dell’anticorpo monoclonale trastuzumab (Herceptin) e del relativo protocollo di cura.

Ri-Arrangiamento del gene ALK

Si tratta di un saggio di Ibridazione in situ con fluorescenza (FISH) che il ri-arrangiamento del gene ALK sul cromosoma 2.
L’esame di ALK trova attualmente indicazione nei pazienti con NSCLC con istotipo adenocarcinoma, carcinoma “a grandi cellule”, carcinoma misto con adenocarcinoma, o NSCLC non altrimenti specificato (NAS). Il trattamento con Crizotinib© è attualmente formalmente indicato nei NSCLC già precedentemente trattati in 1° linea con chemioterapia.
Uno studio recente peraltro (Moka et al., ASCO 2014), ha documentato un vantaggio dall’impiego di Crizotinib© anche in 1° linea, sia in termini di RFS (Release Free Survival) che di risposta.

Microdelezione cromosoma Y

L’analisi delle microdelezioni del cromosoma Y viene oggi considerato un approccio diagnostico essenziale per lo studio dell’infertilità maschile in quanto, insieme alla sindrome di Klinefelter, è la causa principale del fallimento della spermatogenesi.

Queste delezioni sono distribuite sul braccio lungo del cromosoma Y in tre regioni chiamate AZF (Azoospermia Factors) e la loro incidenza è percentualmente più elevata negli individui azoospermici rispetto agli oligospermici.

Queste regioni (AZFa, AZFb e AZFc) contengono geni che controllano il corretto svolgimento della spermatogenesi. Alterazioni a carico di uno o più loci AZF comportano la drastica riduzione delle cellule germinali fino alla loro completa assenza.

Le analisi delle microdelezioni del cromosomaY rivestono di una particolare importanza soprattutto in quelle coppie che si affacciano alla procreazione assistita, per conoscere con più precisione la possibilità di trasmettere ad un figlio lo stesso problema di sterilità del padre.

Pannello della Trombofilia

Le patologie cardiovascolari sono la causa principale di mortalità nei paesi Occidentali. I principali fattori di rischio come il diabete, il fumo, l’ipercolesterolemia, l’ipertensione e l’obesità non rendono ragione di tutti questi casi di malattie. In molti soggetti l’unico fattore di rischio evidente è una storia familiare di malattie cardiovascolari precoce, indice quindi di una predisposizione genetica alla malattia. Pertanto negli ultimi anni si è sviluppato un interesse sempre crescente nei confronti dei potenziali marcatori genetici di rischio cardiovascolare, in modo da poter sviluppare nuove misure preventive e/o terapeutiche. Tra i vari marcatori genetici studiati, sono stati selezionati i geni dei fattori della coagulazione (fattore V, Fattore II, Fattore XIII), della metilentetraidrofolatoreduttasi (MTHFR), della cistationina beta sintesi (CBS), dell’inibitore dell’attivazione del plasminogeno   PAI-1, della Glicoproteina IIIa piastrinica (GPIIIa), dell’enzima di conversione dell’angiotensina (ACE), dell’apolipoproteina E, dell’angiotensinogeno (AGT), del recettore dell’angiotensina II (ATR-1) e del Beta Fibrinogeno (FGB).
Il test si basa sul principio dell’ibridazione inversa su striscia, in base al quale sonde oligonucleotiche specifiche immobilizzate su strisce di nitrocellulosa ibridano con amplificati biotinilati. La perfetta complementarietà tra amplificati e sonda genera un segnale specifico, in seguito a rivelazione colorimetrica.